Alternative screening method for positive pLKO-Clones

Referring to the Addgene’s cloning protocol for the lentiviral vector pLKO.1 I would like to propose an alternative screening method für positive clones.
The original protocol suggested a double digest with EcoRI and NcoI that resulted in two relatively large bands – one at 2kb and one at 5kb. In concequence, the length relations made it hard to reliably identify clones with an intact isert. With this alternative Protocol, conducting a digestion with XhoI, you get a gel picture that is, in my opinion, much easier to interpret.

unfortunately, the protocol is currently only available in German.

Alternatives Screening-Protokoll

Material

• Plasmid Miniprep Kit (Qiagen #27104)
• XhoI (Fermentas #ER0691)
• TopVision LE Agarose (Fermentas #R0491)
• Rotiphorese 10x TBE-Buffer (Carl Roth 3061.1)

Procedere

1. (Tag 1) Nach der Trafo und 16-18h Kultur auf LB-Amp Agarplatten ca. 5-10 Kolonien von der Platte picken und in 3ml LB-Amp übernacht kultivieren.
2. (Tag 2) 2ml der ÜN-Kultur für eine Mini-Präp verwenden,
   Achtung: für den Elutionsschritt ddH₂O oder Tris-HCL Puffer nehmen, da EDTA die anschließenden enzymatischen Reaktionen stören kann. Die restliche Kultur wird vorübergehend im Kühlschrank bei +4°C gelagert oder kann als Glycerolstock eingefroren werden.
3. Für die photometrische Messung des DNA-Gehalts, mache eine 1:100 Verdünnung mit 5µl miniprep DNA und 495µl ddH₂O
4. Setze einen Master-Mix für den Verdau-Ansatz an (plane für n+2 Ansätze).
   Berechne für jeden Ansatz:
   • 1µg miniprep DNA
   • 2µl Puffer R (Fermentas 10x Puffer für XhoI)
   • 0.5µl XhoI
   • auf 20µl ddH₂O
5. Inkubiere die Verdauansätze bei 37°C für 1-2h
6. Trage die Verdauansätze auf ein 1% Agarosegel auf und mache einen Gellauf bei 10V/cm für ca. 45 Minuten.

Positive Klone haben eine deutliche Bande bei 380bp, außerdem eine schwache Bande bei 190bp und den “Rest” bei ~5000bp. Diese Klone sollten zur Sequenzierung eingeschickt werden. Bei nicht intakten Inserts ergibt sich ein Bandenshift von 50-80bp. Klone mit religiertem Stuffer haben außerdem eine Bande bei ~2000bp.