Referring to the Addgene’s cloning protocol for the lentiviral vector pLKO.1 I would like to propose an alternative screening method für positive clones.
The original protocol suggested a double digest with EcoRI and NcoI that resulted in two relatively large bands – one at 2kb and one at 5kb. In concequence, the length relations made it hard to reliably identify clones with an intact isert. With this alternative Protocol, conducting a digestion with XhoI, you get a gel picture that is, in my opinion, much easier to interpret.

unfortunately, the protocol is currently only available in German.

Alternatives Screening-Protokoll

Material

• Plasmid Miniprep Kit (Qiagen #27104)
• XhoI (Fermentas #ER0691)
• TopVision LE Agarose (Fermentas #R0491)
• Rotiphorese 10x TBE-Buffer (Carl Roth 3061.1)

Procedere

1. (Tag 1) Nach der Trafo und 16-18h Kultur auf LB-Amp Agarplatten ca. 5-10 Kolonien von der Platte picken und in 3ml LB-Amp übernacht kultivieren.
2. (Tag 2) 2ml der ÜN-Kultur für eine Mini-Präp verwenden,
   Achtung: für den Elutionsschritt ddH₂O oder Tris-HCL Puffer nehmen, da EDTA die anschließenden enzymatischen Reaktionen stören kann. Die restliche Kultur wird vorübergehend im Kühlschrank bei +4°C gelagert oder kann als Glycerolstock eingefroren werden.
3. Für die photometrische Messung des DNA-Gehalts, mache eine 1:100 Verdünnung mit 5µl miniprep DNA und 495µl ddH₂O
4. Setze einen Master-Mix für den Verdau-Ansatz an (plane für n+2 Ansätze).
   Berechne für jeden Ansatz:
   • 1µg miniprep DNA
   • 2µl Puffer R (Fermentas 10x Puffer für XhoI)
   • 0.5µl XhoI
   • auf 20µl ddH₂O
5. Inkubiere die Verdauansätze bei 37°C für 1-2h
6. Trage die Verdauansätze auf ein 1% Agarosegel auf und mache einen Gellauf bei 10V/cm für ca. 45 Minuten.

Positive Klone haben eine deutliche Bande bei 380bp, außerdem eine schwache Bande bei 190bp und den “Rest” bei ~5000bp. Diese Klone sollten zur Sequenzierung eingeschickt werden. Bei nicht intakten Inserts ergibt sich ein Bandenshift von 50-80bp. Klone mit religiertem Stuffer haben außerdem eine Bande bei ~2000bp.

The last days were filled with bustling activity and brought big changes. two weeks ago my new mentor Peter and i went to the clinic for tumor biology in freiburg to learn a new technique called “spheroid-assay”. this assay can be used to analyse the three-dimensional groth of new blood vessels in a cell culture. we spent the whole day peeking into culture plates, medium flasks and microscopes, thorougly writing down everything. the guys there were great (esp. big thank you to holger and oliver)! So, in the next few months Peter and myself will establish the spheroid-assay at our lab at the pancreas research center in heidelberg.
last week i got a phone call from the surgery’s residency director asking me to begin my clinical work next monday (!) initially i was supposed to start my residency in april… just the other day i gave the first “release candidate” of my medical thesis to dr. schwartz-albiez, who is my supervisor at the dkfz. i keep my fingers crossed that he agrees on submitting the work without further editing. yipee! today i got my medical identity card. now i am officially enabled to get all those fine drugs and pills (just for my own requirements) at the pharmacy